雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒實驗原理與應用方向（雙熒光素酶活動）

更新時間：2024-06-24 點擊次數：1190

活動預覽：文末含李記生物Firefly & Renilla雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒推薦的活動，獎勵內含騰訊會員、音樂會員等，6月28日就kai獎啦，快來參與吧！

和元李記雙熒光素酶產品推薦

— 實驗原理 —

螢火蟲熒光素酶是一種分子量約為61KD的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化Luciferin 氧化成Oxyluciferin，在Luciferin 氧化的過程中，會發出生物熒光。

圖1.螢火蟲熒光素酶催化反應原理

海腎熒光素酶是一種分子量約為36KD的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化Coelenterazine 氧化成Coelenteramide，在Coelenterazine 氧化的過程中也會發出生物熒光。

圖2.海腎熒光素酶催化反應原理

雙熒光素酶報告基因檢測系統在細胞中同時表達螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶，螢火蟲熒光素酶作為報告基因反應目的基因表達的改變，海腎螢光素酶作為內參基因，提供轉錄效率的對照（減少內在變化因素如培養細胞的數目，細胞轉染和裂解的效率對實驗準確性的影響）。兩種熒光素酶沒有種屬同源性并對應不同的反應底物，故而沒有交叉干擾。

— 應用方向 —

一、靶基因驗證

miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用（降解或抑制翻譯），將目的基因3’UTR（野生型和結合位點突變型）序列構建至載體中報告基因Luc的3’端，通過比較過表達miRNA后，報告基因表達的改變（螢光素酶的活性下降還是不變），明確miRNA的作用及miRNA與靶基因3’UTR的作用位點。

圖3.靶基因驗證實驗設計原理

相關實驗適用類型：miRNA-靶基因（mRNA、LncRNA、circRNA）、m6A位點、增強子

二、啟動子活性驗證

轉錄因子主要通過作用于靶基因的啟動子起作用，將目的基因啟動子區序列構建在報告基因Luc的5’端，通過共表達轉錄因子后，根據報告基因表達的改變，來確定轉錄因子與靶基因啟動子結合位點及對靶基因的作用。

圖4.啟動子驗證實驗設計原理

— 應用示例 —

1、示例一

文章標題：METTL14/miR-29c-3p axis drives aerobic glycolysis to promote triple-negative breast cancer progression though TRIM9-mediated PKM2 ubiquitination

發表期刊：Journal of cellular and molecular medicine

和元助力：將WT TRIM9-3’UTR 和突變型 TRIM9-3‘UTR 構建至pMIR-REPORT載體，通過共轉染miR-29c-3p mimics, miR-29c-3p inhibitor和 miRNA-NC，明確了miR-29c-3p與TRIM9的結合。

2、示例二

文章標題：The ELAVL3/MYCN positive feedback loop provides a therapeutic target for neuroendocrine prostate cancer

發表期刊：Nature communications

和元助力：為了闡明MYCN轉錄調控的分子機制，作者分別將ELAVL3的全長以及Segments A, B, C的啟動子構建到luciferase報告基因載體上。通過雙熒光素酶報告基因實驗，發現MYCN顯著上調full-length ELAVL3和ELAVL3 Segment A兩組的luciferase信號，證明了MYCN對 ELAVL3的轉錄調控。

3、示例三

文章標題：METTL3 facilitates stemness properties and tumorigenicity of cancer stem cells in hepatocellular carcinoma through the SOCS3/JAK2/STAT3 signaling pathway

發表期刊：Cancer gene therapy

和元助力：SOCS3的CDS區，包含m6A識別位點野生型（GGACU）以及突變型（CCTGA），被構建在pMIR-REPORT載體上。通過過表達和干擾METTL3的表達，同時利用雙熒光素酶報告基因實驗證實了METTL3和SOCS3的相互作用。