EZ ECL Femto化學(xué)發(fā)光液（飛克級(jí)）

1. 取出印記膜，加入合適的封閉液在溫室下孵育20~60 min，同時(shí)振蕩，以封閉膜上非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)。

2. 將膜從封閉液中取出，與一抗工作液在溫室孵育1 h，同時(shí)振蕩；或在28℃孵育過夜，不振蕩。

3. 將足量的洗滌緩沖液加至膜上，保證緩沖液將膜*覆蓋。振蕩孵育≥5 min，更換洗滌緩沖液并重復(fù)該步驟4~6次。增加洗滌緩沖液體積，洗滌次數(shù)和洗滌時(shí)間有助于降低背景信號(hào)。【注】：①孵育前，膜在洗滌緩沖液中的短暫淋洗會(huì)提高洗滌效率。②按前文建議的HRP標(biāo)記二抗稀釋度非常重要的。

4. 將HRP標(biāo)記的二抗工作液與膜在溫室孵育1 h，同時(shí)振蕩。

5. 重復(fù)步驟3，以除去未結(jié)合的HRP標(biāo)記二抗。【注】：膜與HRP標(biāo)記二抗孵育后必須進(jìn)行*洗滌。

6. 將A溶液與B液等比例混合，制備成工作液。每cm²膜使用0.01~0.1 mL工作液，工作液可以在溫室下穩(wěn)定8 h。
   【注】：暴露于日光或其他強(qiáng)光下可能損害工作液，為獲得最佳結(jié)果，請(qǐng)將此工作液保存在琥珀色瓶中光；實(shí)驗(yàn)室的常見照明不會(huì)損害工作液。

7. 將印記膜在工作液中孵育5 min。從工作液中取出印記膜，并置于一個(gè)塑料片或清潔的塑料紙（膜）中，用一張吸水紙吸除多余的液體，并從印記和塑料紙之間小心地壓出氣泡。

8. 將包在塑料紙（膜）中的印記膜置于膠片暗盒中，蛋白質(zhì)面朝上，除適用于膠片曝光的燈（如紅色安全燈）之外，關(guān)閉所有的燈。
   【注】：①膠片必須在曝光期間保持干燥；②確保將多余的底物從膜和塑料紙上*去除；③在整個(gè)膠片處理期間，使用手套。

9. 將X光膠片置于膜的上面。建議第一次曝光60 s。之后可調(diào)整曝光時(shí)間以達(dá)到最佳結(jié)果。化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在底物孵育后的前5~30 min期間是強(qiáng)烈的。這一反應(yīng)可以持續(xù)幾個(gè)小時(shí)，但強(qiáng)度會(huì)隨時(shí)間下降，如有底物孵育后較長(zhǎng)時(shí)間后曝光，曝光時(shí)間可能需要延長(zhǎng)以獲得較強(qiáng)信號(hào)。如果使用磷光存儲(chǔ)成像設(shè)備（如Bio-Rad的分子成像儀系統(tǒng)）或CCD照相機(jī)可能需要較長(zhǎng)的曝光時(shí)間。
   【注】：膠片與膜之間的任何移動(dòng)可能在膠片上造成人為的非特異信號(hào)。

10. 使用合適的顯影劑和定影劑對(duì)膠片進(jìn)行顯影。如果信號(hào)太強(qiáng)，則縮短曝光時(shí)間或?qū)⒂∮浤みM(jìn)行剝離并降低抗體濃度重新檢測(cè)。

1. 本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2. 為獲得最佳效果，必須優(yōu)化該系統(tǒng)的全部組分，包括樣品量、一抗和二抗?jié)舛纫约澳ず头忾]試劑的類型。

3. 使用本產(chǎn)品比使用沉淀比色HRP底物檢測(cè)所需的抗體濃度低。為優(yōu)化抗體濃度，請(qǐng)進(jìn)行一次系統(tǒng)的點(diǎn)印跡分析。

4. 沒有一種封閉試劑對(duì)所有系統(tǒng)而言都是最佳的，所以為每一個(gè)免疫印跡檢測(cè)系統(tǒng)找到最合適的封閉緩沖液非常必需。封閉試劑有可能與抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性信號(hào)。封閉緩沖液同時(shí)也會(huì)影響系統(tǒng)的靈敏性。當(dāng)從一種底物轉(zhuǎn)換為另一種底物時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)信號(hào)衰減或背景增加的現(xiàn)象，原因可能是封閉緩沖液不適合新的檢測(cè)系統(tǒng)。

5. 使用親和素/生*素檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，避免使用牛奶作為封閉試劑，因?yàn)榕Ｄ讨泻胁欢康膬?nèi)源性生*素，會(huì)導(dǎo)致高背景信號(hào)。

6. 保證洗滌緩沖液、封閉緩沖液、抗體溶液和底物工作液的使用體積，以確保在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中印跡膜*被液體覆蓋，避免膜變干。增大封閉緩沖液及洗滌緩沖液的使用量可以降低非特異性的信號(hào)。

7. 為獲得最佳效果，在孵育步驟請(qǐng)使用搖床。

8. 將Tween20(終濃度0.05~0.1%)加入封閉緩沖液和稀釋的抗體溶液，以降低非特異信號(hào)。使用高品質(zhì)的產(chǎn)品，如去污劑。它保存在安瓿中，過氧化物和其他雜質(zhì)含量很低。

9. 不要使用疊氮鈉作為緩沖液的防腐劑。疊氮鈉是HRP的抑制。

10. 避免手與膜直接接觸，實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)戴手套或使用干凈的鑷子。

11. 所有設(shè)備必須清潔且不沾染外來物質(zhì)。金屬器械（如剪刀）不得具有可見的銹跡。銹跡可能導(dǎo)致斑點(diǎn)形成和高背景。

12. 底物工作液在室溫下可穩(wěn)定8 h。日光或任何其他強(qiáng)光下可能損害底物，為獲得最佳結(jié)果，將底物工作液保存在琥珀色瓶中，并避免長(zhǎng)期暴漏在任何強(qiáng)光下，短時(shí)間暴漏于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)照明不會(huì)損害該工作液。